重組蛋白是運(yùn)用基因重組技術(shù)，獲得的具有一定功能和活性的蛋白質(zhì)。隨著生物藥物開發(fā)、重組蛋白表達(dá)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域，低成本、短周期、高純度活性蛋白的需求量也與日俱增。相比于天然蛋白，重組蛋白更適用于科學(xué)研究領(lǐng)域，是生物藥、細(xì)胞免疫治療及IVD試劑研發(fā)生產(chǎn)中不可或缺的關(guān)鍵生物試劑。

四大蛋白表達(dá)系統(tǒng)

• 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（E. coli Expression System）在基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，是目前應(yīng)用最廣泛的原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌是表達(dá)小分子細(xì)胞質(zhì)蛋白或結(jié)構(gòu)域的首選宿主，具有遺傳背景清楚，生產(chǎn)時(shí)間短，成本低，易于放大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
• 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)（Pichia Pastoris Expression System）是一種最經(jīng)濟(jì)高效的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，可以對(duì)多數(shù)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，能夠制備非常接近于天然蛋白的蛋白原料。
• 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirus Expression Vector System）是科研和工業(yè)常用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，可以容納較大的外源片段插入，并且通過(guò)該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，具有完整的生物學(xué)功能。
• 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（Mammalian Cell Expression System）表達(dá)的重組蛋白，天然結(jié)構(gòu)完整，生物活性接近于天然蛋白質(zhì)，因此在生物制藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

蛋白純化策略

為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，首先應(yīng)該將目標(biāo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞裂解液的全部組分中分離出來(lái)，同時(shí)需要保留目標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性及化學(xué)完整性。不同蛋白質(zhì)的氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其在物理、化學(xué)、生物學(xué)等性質(zhì)上存在差異，利用待分離蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)性質(zhì)上的差異，即可以設(shè)計(jì)出一套合理的蛋白純化方案。

蛋白純化方法

純化蛋白的方法主要可以分為三類：沉淀、離心和層析。

• 鹽析沉淀是在蛋白質(zhì)水溶液中加入中性鹽，隨著鹽濃度增大而使蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)的方法。等電點(diǎn)沉淀是利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低而不同蛋白質(zhì)又具有不同等電點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行分離的方法。有機(jī)溶劑沉淀是利用與水互溶的有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低而沉淀的方法。
• 速率區(qū)帶離心是根據(jù)顆粒在介質(zhì)中的沉降速度不同來(lái)分離試樣的方法。差速離心是逐漸提高離心速度來(lái)分離不同大小的細(xì)胞器的方法。
• 疏水相互影響層析是利用蛋白質(zhì)表面的疏水部位和固定相上的疏水基團(tuán)的結(jié)合來(lái)分離不同蛋白質(zhì)的方法。凝膠層析是利用混合物隨流動(dòng)性相流過(guò)配有凝膠固定不動(dòng)相的層析柱時(shí)速度不一致而分離的方法。上述方法由于存在特異性低、純化蛋白純度不高和活性低等缺點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中用的頻次比較低。應(yīng)用較多的純化方法是層析法中的親和層析和離子交換層析。

親和層析是利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離不同分子的方法。當(dāng)含有被分離物質(zhì)的混合物隨著流動(dòng)相流經(jīng)層析柱時(shí)，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附能與其結(jié)合的物質(zhì)，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)未被吸附，從層析柱中流出。

離子交換層析是一種以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇性系數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離的方法。當(dāng)一定量的溶液通過(guò)交換柱時(shí)，由于溶液中的離子不斷被交換而濃度逐漸減少，因此也可以全部被交換而吸附在交換劑上。融合的蛋白質(zhì)能夠根據(jù)逐漸提升過(guò)柱液中的含鹽量或者提升過(guò)柱液的pH值過(guò)柱出來(lái)。

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參考文獻(xiàn)：

Labrou NE. Protein purification: an overview. Methods Mol Biol. 2014;1129:3-10. doi: 10.1007/978-1-62703-977-2_1.